语言：简体中文
作者：梁秦龙，王梅，王冰，赵继元
【摘要】 目的 研究survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法 人工合成survivin ASODN，脂质体介导转染人恶性黑素瘤细胞株A375，采用原位杂交、免疫组化SP法检测survivin mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24 h后，ASODN组A375细胞survivin mRNA表达较对照组显著下调(P<0.01)；转染48 h后，与对照组相比，ASODN组细胞的survivin蛋白水平显著下降(P<0.01)。结论 Survivin ASODN可下调A375细胞survivin mRNA的表达和survivin蛋白水平。
【关键词】 survivin 恶性黑色素瘤 反义寡核苷酸
ABSTRACT: Objective To study the effects of survivin antisense oligodexynucleotide (ASODN) on the expression of survivin mRNA and its protein in human malignant melanoma cell line A375. Methods Survivin ASODN was synthesized and transfected into melanoma cell line A375 by the liposome-encapsulation. Survivin mRNA and protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry， respectively. Results At 24h after the transfection， the expression of survivin mRNA was significantly lower in the ASODN group than in the control group (P<0.01). The expression of survivin protein was also significantly decreased in the ASODN group than in the control group at 48h after transfection (P<0.01). Conclusion Survivin ASODN can down-regulate the expression of survivin mRNA and its protein in A375 cells.
KEY WORDS: survivin; malignant melanoma; antisense oligonucleotide
Survivin是新近发现的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein， IAP)，表达于人类大多数肿瘤组织，但是在正常成人组织不表达(胸腺除外)［1］，与肿瘤发生、发展及治疗抵抗密切相关。在恶性黑素瘤皮损［2］及其细胞株中［3］都存在survivin过表达。本研究以survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide， ASODN)转染体外培养的恶性黑素瘤细胞株A375，分别用原位杂交和免疫组化的方法检测人恶性黑素瘤细胞survivin mRNA表达及其蛋白水平的变化，初步探讨反义寡核苷酸的作用机制，为survivin ASODN治疗恶性黑素瘤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人恶性黑素瘤细胞株A375购于第四军医大学口腔生物学教研室；Oligofectamine转染试剂购自Invitrogen公司；Survivin原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司；羊抗人survivin多克隆抗体sc-8806购自Santa Cruz公司；SP免疫组织化学试剂盒购自中山生物公司。
1.2 全硫代寡核苷酸设计、合成和修饰
Survivin反义寡核苷酸序列设计参照文献［4］，由18个碱基组成，序列如下：5＇-TGTGCTATTCTGTGAATT-3＇。寡核苷酸的合成及全硫代磷酸化修饰均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.3 细胞培养
复苏人源性恶性黑素瘤细胞株A375，用含10 mL/L胎牛血清RPMI-1640培养基培养，2-3 d传代一次。
1.4 原位杂交测定survivin mRNA
将无菌盖玻片放入24孔培养板，以4×104 /mL浓度接种细胞，6 h后各孔分别置换为不含血清的、含ASODN的试验用培养液0.66 mL。ASODN的处理浓度设为20 μmol/L，脂质体终浓度为1 mL/L。实验分ASODN处理组和空白对照组：①ASODN处理组，即试验用培养液含20 μmol/L ASODN；②空白对照组，即不含血清的RPMI-1640培养液。在无血清条件下阻断4 h后，各孔均加入含30 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液0.34 mL，继续培养24 h后，倾出培养液，40 g/L多聚甲醛固定，按试剂盒程序进行原位杂交检测。每组测定3张切片，使用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统，随机选取每张细胞片中不相重叠的400倍视野，共计数50个细胞，进行细胞阳性程度的测定，计算每组阳性细胞的平均染色灰度值，以确定细胞中survivin mRNA的相对含量。
1.5 免疫组化测定survivin蛋白的水平
细胞接种、分组和处理方法同原位杂交。进行4 h无血清阻断，再培养48 h后，倾出培养液，冷丙酮固定，免疫组化按试剂盒程序进行。取未经复染的免疫组化染色结果进行图像分析，利用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统，分析转染前后人恶性黑色素瘤细胞中survivin蛋白表达的相对含量，每组选取3张切片，每张切片随机选择5个高倍镜测量视野，计数50个细胞，由计算机给出平均光吸收数值。
1.6 统计学处理
数据均采用平均数加减标准差表示。应用t检验进行统计分析，显著性差异取P<0.05。
免费论文下载中心 http://www.hi138.com2 结 果
2.1 Survivin ASODN下调A375细胞survivin mRNA的表达
光镜显示对照组阳性细胞杂交信号位于胞浆，呈颗粒状，棕黄色(图1)。ASODN处理组胞浆中杂交信号与对照组比较明显减弱(图2)。说明转染ASODN后细胞survivin mRNA的翻译受到抑制。阴性对照结果均为阴性。用图像分析系统对阳性染色的强度(灰度值)进行半定量测定，灰度值与阳性强度成反比，灰度值越小，染色越强。两组细胞所测结果如表1所示。对照组平均灰度值为109.8±12.8，而ASODN处理组为188.6±8.2，两组经独立样本t检验显示差异有统计学意义(P<0.001)。表1 各组A375细胞survivin 原位杂交染色图像分析的灰度值（略）
2.2 Survivin ASODN降低A375细胞survivin蛋白表达的水平
免疫组化染色显示A375细胞survivin蛋白免疫阳性反应呈棕黄色，主要分布于胞浆。正常对照组阳性细胞染色较深(图3)。而survivin反义寡核苷酸在处理细胞48 h后，胞浆内染色强度明显减弱(图4)，表明survivin蛋白合成受到抑制。两实验组所测细胞平均灰度值如表2所示。对照组平均灰度值为111.6±8.8，而ASODN处理组为186.0±9.3，两组经独立样本t检验显示差异有统计学意义(P<0.001)。表2 各组A375细胞survivin 免疫组化染色图像分析的灰度值（略）
3 讨论
恶性黑素瘤对化疗等多种通过凋亡途径杀伤肿瘤细胞的治疗方法疗效均不理想。近年来利用反义核酸技术选择性地封闭与细胞增殖、凋亡及耐药密切相关的靶基因，在恶性黑素瘤研究中取得了较大进展，为恶性黑素瘤的治疗提供了新的途径。
反义寡核甘酸是一类以碱基配对原则与特定的靶互补结合的小分子量的，可扩散的寡核甘酸序列［5］。能从翻译水平、转录和核酸复制水平高度特异地抑制靶基因的翻译和表达，选择性地关闭特定的靶基因。因其具有精确的选择性和高度的特异性，而成为一项具有价值的研究工具和治疗恶性肿瘤的重要策略［6］。
Survivin在正常分化成熟的组织和肿瘤组织中差异表达使其成为肿瘤治疗理想的靶基因［7］。王颖等［8］用survivin ASODN体外经脂质体介导转染hepG2细胞，可明显降低细胞survivin表达，抑制肿瘤生长，诱导凋亡，明显增加肝癌细胞对化疗药物5-FU和DDP的敏感性，从而达到治疗的目的。我们先前的研究［3］已证实人恶性黑素瘤细胞株A375中存在survivin过表达，并对survivin ASODN转染A375细胞时ASODN及脂质体浓度及相应的细胞培养条件进行了优化选择。基于以上实验基础，本研究以survivin ASODN转染A375细胞，转染24 h后，原位杂交显示ASODN处理组A375细胞survivin mRNA的表达水平低于正常对照组。此结果与反义寡核苷酸特异性的活动机制相吻合，即通过抑制转录和降解靶mRNA，导致survivin mRNA水平降低。进一步于转染48 h后，免疫组织化学方法检测到ASODN处理细胞后survivin蛋白表达降低。印证了反义寡核苷酸通过序列特异性与靶mRNA结合，阻断了蛋白质的翻译过程，引起蛋白表达水平降低。实验间接证明了survivin ASODN经脂质体介导体外转染A375细胞是成功的，属有效转染。我们推测恶性黑素瘤中survivin过表达与恶性黑素瘤凋亡抵抗及对放化疗不敏感密切相关，体外实验survivin ASODN能诱导survivin mRNA和蛋白水平的下调，初步为survivin ASODN用于恶性黑素瘤的治疗及提高对传统治疗的敏感性提供了实验依据。
参考文献
［1］Sah NK， Khan Z， Khan GJ， et al. Structural， functional and therapeutic biology of surviving ［J］. Cancer Lett， 2006， 244(2):164-171.
［2］Grossman D， McNiff JM， Li F， et al. Expression and targeting of the apoptosis inhibitor， survivin， in human melanoma ［J］. J Invest Dermatol， 1999， 113(6):1076-1081.
［3］王梅，王冰，谭升顺. 反义寡核苷酸转染A375细胞实验条件的优化 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(5):502-505.
［4］Olie RA， Simoes-Wust P， Baumann B， et al. A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy ［J］. Cancer Res， 2000， 60(11):2805-2809.
［5］Chan JH， Lim S， Wong WS. Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic application ［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol， 2006， 33(5-6):533-540.
［6］Leonetti C， Zupi G. Targeting different signaling pathways with antisense oligonucleotides combination for cancer therapy ［J］. Curr Pharm Des， 2007， 13(5):463-470.
［7］Zaffaroni N， Pennati M， Daidone MG. Survivin as a target for new anticancer interventions ［J］. J Cell Mol Med， 2005， 9(2):360-372.
［8］王颖，王家，马窀，等. 原发性肝癌survivin基因表达及靶向survivin治疗 ［J］. World Chin J Digestol， 2005， 13(9):1082-1088. 免费论文下载中心 http://www.hi138.com